Bioimpresión 3D in situ con biotinta de biohormigón

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 3597 (2022) Citar este artículo

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La bioimpresión in situ resulta atractiva para depositar directamente la biotinta terapéutica en los órganos defectuosos para repararlos, especialmente para ocupaciones como soldados, atletas y conductores que pueden resultar lesionados en caso de emergencia. Sin embargo, la biotinta tradicional muestra limitaciones obvias en sus complejos entornos operativos. Aquí, diseñamos una biotinta de biohormigón con microgeles cargados de células electropulverizados como agregado y una solución precursora de metacriloilo de gelatina (GelMA) como cemento. Se garantiza una capacidad de impresión prometedora con un amplio rango de temperaturas que se beneficia de las sólidas propiedades reológicas del agregado de microgel fotoentrecruzado y la fluidez del cemento GelMA. Los componentes compuestos se autoadaptan simultáneamente a la biocompatibilidad y a diferentes microambientes mecánicos de los tejidos. La fuerte unión en la interfaz tejido-hidrogel se logra mediante enlaces de hidrógeno y fricción cuando el cemento se fotoreticula. Esta biotinta posee una buena portabilidad y puede prepararse fácilmente en caso de accidentes urgentes. Mientras tanto, los microgeles se pueden cultivar en minitejidos y luego mezclarlos como agregados de biotinta, lo que indica que nuestro biohormigón se puede funcionalizar más rápido que los biotintas normales. Los resultados de la reparación de defectos craneales verifican la superioridad de este bioink y su potencial en entornos clínicos requeridos en el tratamiento in situ.

Como tratamiento emergente de defectos orgánicos, la “bioimpresión in situ”1 propuesta inicialmente por Campbell2. ha ido captando la atención en la clínica. En resumen, la biotinta terapéutica se deposita directamente en las heridas de los pacientes mediante bioimpresoras quirúrgicas a lo largo de recorridos de acuerdo con sus morfologías 3D3. Actualmente, utiliza principalmente métodos similares para la bioimpresión in vitro y se ha aplicado en tratamientos de piel, cartílagos y huesos4. En comparación con la implantación de órganos basada en bioimpresión 3D in vitro, tiene más ventajas por su función de deposición in situ (Nota complementaria 1).

Sin embargo, la bioimpresión in situ es rudimentaria y ha estado restringida en aplicaciones clínicas. Además de la falta de bioimpresoras in situ4 confiables, una de las principales razones es que hay biotintas menos adecuadas que cumplan con sus requisitos especiales. En los estudios relevantes existentes, la biotinta aplicada es en gran medida similar a la de la bioimpresión in vitro, es decir, la solución precursora, que no es una opción prometedora para la bioimpresión in situ. (i) En la mayoría de los casos de bioimpresión in situ, no existen condiciones para controlar estrictamente las propiedades reológicas de la biotinta, especialmente la biotinta termosensible. (ii) A diferencia de los sótanos receptores con superficie limpia y temperatura controlable en las bioimpresoras in vitro, la bioimpresión in situ tiene un sótano receptor especial, es decir, las heridas del paciente con una temperatura constante (37 °C) y sangre, que pueden colapsar el material impreso. estructura antes de la reticulación. (iii) La biotinta reticulada debe poseer un módulo mecánico bajo para que las células encapsuladas ejerzan funciones terapéuticas. (iv) Las estructuras deben tener altas propiedades mecánicas que coincidan con el defecto, protegiéndose de daños durante la reparación, lo que, sin embargo, conduce a una enorme contradicción con el requisito (iii). La construcción de estructuras compuestas, es decir, la impresión de andamios resistentes seguidos de la fundición de hidrogel blando, se ha convertido en una solución eficaz5,6,7,8. Sin embargo, un proceso de impresión tan complejo no se puede realizar en la bioimpresión in situ. (v) Se debe formar una fuerte fuerza de unión en la interfaz de la estructura impresa con defectos. (vi) La biotinta in situ debe ser portátil y fácil de preparar para ocupaciones como soldados, atletas y conductores que pueden resultar lesionados en caso de emergencia.

Los microgeles se han convertido en estructuras de bioimpresión populares en terapia celular9, liberación controlada de fármacos10, modelado de enfermedades11, etc., y se han propuesto muchos métodos de fabricación12,13,14,15,16. Recientemente, además de la unidad de función independiente, en la revisión sobre microgeles publicada en Nature Reviews por Burdick et al. 17 en 2020, se ha predicho la amplia aplicación de la “bioimpresión secundaria”18,19,20,21 de microgeles como componente de biotinta en el futuro. En el último trabajo de Alge et al. 22 publicado en Science Advances en 2021, se presentó una investigación en profundidad sobre el proceso de disipación de microgeles durante la impresión. Wang y cols. 9 microgeles de alginato inyectados para reparar defectos de órganos de ratas. Burdick y cols. 23,24 microgeles recolectados extruidos para establecer estructuras 3D específicas. Toda la investigación se benefició no solo de la prometedora biocompatibilidad de los microgeles sino también de sus propiedades reológicas únicas similares al fluido de Bingham25,26,27, que se muestra como elastómero bajo cierta tensión pero fluye como fluido de Newton una vez que la tensión aumenta aún más. Por lo tanto, la biotinta basada en microgel tiene el potencial de diseñarse aún más como una nueva biotinta clínica de bioimpresión in situ para adaptar los complicados requisitos.

En este trabajo desarrollamos la biotinta de biohormigón (biotinta A–C) para bioimpresión in situ, cuyo nombre proviene de hormigón para la construcción y su abreviatura proviene de los dos componentes principales: agregado (A) y cemento (C) ( Fig. 1, vídeos complementarios 1 y 2). Los microgeles GelMA electropulverizados (500 μm) se utilizan como componente principal (A) para obtener propiedades reológicas sólidas similares al fluido de Bingham en entornos complejos (Notas complementarias 3 y 4). La solución precursora GelMA (con fotoiniciador) se utiliza como componente auxiliar (C) para garantizar la fluidez y la imprimibilidad. La estructura compuesta fotorreticulada posee una estructura A/C con módulo mecánico bajo/alto, respectivamente, lo que resuelve perfectamente la contradicción entre mantener la biocompatibilidad para las células de terapia cargadas y soportar la alta tensión de tracción/compresión alrededor del defecto. Además, el componente C puede infiltrarse fácilmente en la superficie de la herida y formar enlaces de hidrógeno y de alta fricción interna en la interfaz defecto-hidrogel después de la fotoreticulación. Convenientemente, esta biotinta es portátil porque el componente del aire acondicionado se puede conservar en nitrógeno líquido, que puede descongelarse con dispositivos de calefacción o a temperatura corporal en caso de accidente. Mientras tanto, los microgeles se pueden cultivar en minitejidos antes de mezclarlos, lo que indica que nuestra biotinta de bioconcreto se puede funcionalizar más rápido que los tradicionales. Los resultados del tratamiento in situ de los defectos craneales de ratas verifican su potencial en entornos clínicos en bioimpresión in situ en el futuro.

Los paneles superiores muestran las propiedades de la biotinta A-C propuesta inspirada en el hormigón para la construcción. Los paneles inferiores (I-VI) muestran el uso de biotinta A – C.

El grado de sustitución (DS) de GelMA se puede modificar fácilmente cambiando las proporciones de gelatina y ácido metacrílico. Una mayor concentración de DS y de la solución precursora da como resultado propiedades mecánicas más altas de las estructuras fotoentrecruzadas28,29. Según nuestra experiencia, el GelMA con bajo contenido de DS (EFL-GM-30) al 5 % (p/v) tiene propiedades mecánicas bajas y una alta biocompatibilidad. Por lo tanto, se seleccionó para electropulverizar microgeles GelMA (A30/5, 500 μm), que se ha verificado que poseen diámetros muy uniformes (Nota complementaria 4 y Fig. 6 complementaria). Un 20% (p/v) de GelMA con alto contenido de DS (EFL-GM-300) puede soportar tensiones de compresión, como el tejido óseo, mientras que un 20% (p/v) de GelMA con bajo contenido de DS (EFL-GM-30) puede soportar el estiramiento. estrés, como el tejido tendinoso. Por tanto, fueron seleccionados como componente C (C300/20, C30/20). A modo de comparación, también se seleccionó GelMA de bajo DS (EFL-GM-30) al 5 % (p/v) como componente C (C30/5).

Supusimos que el componente C se infiltró exactamente en la vacante entre el componente A para que los microgeles pudieran generar suficiente fricción interna para evitar el colapso antes de la reticulación. El A30/5 acumulado (con GFP) en el tamiz celular se empapó repetidamente en C30/5 (con RFP) y se levantó para filtrar el C30/5 redundante (Fig. 2a). C30/5 entró espontáneamente en la vacante entre A30/5 con fuerza capilar. La biotinta A-C reticulada mostró que los componentes A estaban estrechamente unidos entre sí (Fig. 2b, c). La proporción de volumen del componente A se analizó en áreas rojas/verdes como 73,215 ± 2,312% (Nota complementaria 2), que fue similar a la utilización del espacio atómico en el empaquetado hexagonal más cercano (HCP) en química cristalina (74,05%) (Fig. 2d). en el sentido de que el componente A mostraba una forma esferoide estándar bajo flotación y tensión superficial en el componente C líquido y el sistema tendía a poseer la energía más baja bajo gravedad.

a Bosquejo del método de humectación en el experimento de análisis de proporción de volumen. b Morfología óptica de la estructura compuesta A – C. c Morfología fluorescente de la estructura compuesta A – C (Zen, Carl Zeiss, versión 8,0,0,273). d Enrejado de paquete de armario hexagonal en química cristalina. e Las piezas del kit de biotinta A–C. f – k Los pasos de preparación de la biotinta A – C portátil. Para b, c, cada experimento se repitió de forma independiente con resultados similares 3 veces.

Se diseñó una bolsa de emergencia para cumplir con los requisitos de almacenamiento y portabilidad (Fig. 2e). Se sumergieron células de carga de componentes en medio de criopreservación y se almacenaron en un tubo de congelación como lo describieron previamente Ouyang et al. 30. El componente C también se almacenó en otro tubo de congelación. Las proporciones en volumen del componente de A/C en un kit fueron 74,05%/25,95%, respectivamente. Ambos tubos de congelación se almacenaron en un recipiente lleno de nitrógeno líquido.

En un accidente, los tubos de congelación se retiraron del recipiente y se descongelaron con una pequeña almohadilla térmica a 37 °C alimentada por una batería USB portátil (Fig. 2f). En caso de accidentes muy urgentes sin dispositivos de calefacción, estos se pueden calentar directamente utilizando la temperatura corporal. Sin duda, se debe notar la lesión por frío en la piel del paciente. Luego, se eliminó el medio de criopreservación mediante una jeringa y una servilleta. Se transfirió un componente al componente C con una cuchara fina y se agitó uniformemente, seguido de la transferencia de biotinta A-C a una nueva jeringa con boquilla de impresión cónica para bioimpresión in situ con bioimpresoras in situ profesionales o simplemente con las manos, seguido de fotoentrecruzamiento con 405. Linterna azul de -nm, que se ha comprobado que es segura y ampliamente utilizada en escenas clínicas actuales, como fotocurado dental, tratamiento con luz azul de ictericia neonatal, etc.

En la práctica, el volumen total de biotinta está determinado por los volúmenes y cantidades de los tubos de congelación aplicados. Al final de la producción de biotinta A – C, la biotinta A – C preparada se puede cargar con diferentes tipos de tubos de congelación según los requisitos de producción. Además, al final del rescate, en términos de cantidades de tubos de congelación, los rescatistas definitivamente pueden tomar tantos tubos de congelación cargando biotinta A-C como sea posible según la situación de lesión del paciente. Por lo tanto, con un mayor desarrollo y producción en masa de biotinta A – C, este sistema de biotinta sería factible para la bioimpresión in situ de defectos tisulares lo más grandes posible.

La biotinta A – C debe poseer una alta robustez reológica en diferentes condiciones de temperatura para adaptarse a diferentes situaciones de accidente del tratamiento in situ. Se prepararon A30/5 – C30/20, A30/5 – C300/20, A30/5 – C30/5 y C bioink C30/20, C300/20, C30/5. Se seleccionaron 4, 24 y 37 °C, bajo los cuales la solución precursora de GelMA estaría en estado de gelificación excesiva, sol-gel optimizado y solización excesiva para extruir bioimpresión, respectivamente31,32.

Los resultados del barrido de flujo indicaron que tanto las biotintas A – C como las biotintas C tenían una función de adelgazamiento por cizallamiento en las tres temperaturas seleccionadas (Fig. 3c), cumpliendo con el requisito básico de extrusión de bioimpresión. Esto se debió a que los microgeles GelMA se separaron entre sí y la fricción entre ellos desapareció a una alta velocidad de cizallamiento. Además, la orientación de las moléculas discretas de GelMA en el componente C tendió a ser coincidente y se redujo el entrelazamiento de moléculas (Fig. 3a). Según estudios publicados9,33, el sistema compuesto principalmente por microgeles tenía propiedades de fluido de Bingham. Los datos de barrido de flujo de las biotintas A – C se ajustaron además con el modelo de fluido de Bingham de la siguiente manera:

en el que \(\sigma\), \({\sigma }_{\rm {{y}}}\), \({\eta }_{{\rm {B}}}\) y \(\ dot{\gamma }\) es tensión, límite elástico, viscosidad de Bingham y velocidad de corte, respectivamente. Todas las biotintas A – C mostraron una característica del fluido de Bingham y una relación lineal entre la tensión y la velocidad de corte por encima de cierta tensión (Fig. 3d, e). El límite elástico aumentó a 4 ° C debido a la gelificación excesiva del componente C durante la cual las moléculas de GelMA formarían espiroquetas similares a colágeno, agregados de espiroquetas y redes agregadas en sucesión (Fig. 3b). La característica sólido/fluido por debajo/por encima del límite elástico se debió a la fricción interna entre el componente A y la mala posición de los microgeles más allá de la fricción estática, respectivamente.

a El mecanismo de la característica de adelgazamiento por cizallamiento de la biotinta A – C. b El mecanismo de transferencia sol-gel de la solución precursora de GelMA. c Prueba de barrido de flujo. d Montaje con modelo de fluido Bingham. e Estrés de rendimiento. (n = 3 experimentos independientes. Los datos se presentan como valor medio ± DE.) f Prueba de frecuencia de oscilación. g Prueba de tixotropía. h Prueba de rampa de temperatura del flujo reciclado.

La biotinta debe tener fluidez para formar filamentos a partir de boquillas y mostrar características sólidas para mantener la forma. Los resultados de las pruebas de frecuencia de oscilación mostraron que todos los biotintas A – C bajo diferentes temperaturas poseían una característica sólido/fluido bajo baja/alta frecuencia, respectivamente, beneficiándose de la propiedad del fluido Bingham (Fig. 3f). Sorprendentemente, la biotinta GelMA monocomponente tradicional se transferiría a la solización y no podría mantener la forma a la temperatura corporal (37 °C). Sin embargo, incluso por debajo de 37 °C, la biotinta A-C todavía mostraba un estado sólido a baja frecuencia, lo que verifica su viabilidad para depositarse en las heridas. Los resultados de la tixotropía al agregar amplitudes de oscilación periódicamente variadas (200% y 1%) indican que la transferencia de estado de la biotinta A-C fue rápida y obvia, lo que confirma su rápida velocidad de autocuración. (Figura 3g)

Las biotintas termosensibles necesitan tiempo para alcanzar un estado estable bajo cierta temperatura. Además, para una determinada temperatura, el estado sol-gel en un momento determinado se vería afectado por el estado anterior y totalmente diferente durante el proceso de aumento/disminución de la temperatura. Se llevó a cabo una prueba de rampa de temperatura de flujo de biotinta A – C y C para examinar la variación de la viscosidad en temperaturas que aumentan/disminuyen repetidamente (4–39 ° C, 5 ° C / min) durante tres veces (I – III) (Fig. 3h ). Los resultados mostraron que incluso las curvas de viscosidad del proceso de aumento/disminución de temperatura de la misma biotinta no se superpusieron, verificando una mala reversibilidad y estabilidad del estado de la biotinta termosensible. Sin embargo, en comparación con la biotinta C, las zonas rodeadas por las curvas de viscosidad en las tres pruebas continuas de la biotinta A-C estaban casi superpuestas, lo que indica que la biotinta A-C podría evitar eficazmente el efecto del estado anterior. Además, para un rango de cambio de temperatura tan amplio, la viscosidad de la biotinta C se estiró de 4 a 5 magnitudes, mientras que la de la biotinta A-C se mantuvo dentro de 1 magnitud debido al papel dominante de los microgeles. Sorprendentemente, las prometedoras temperaturas de bioimpresión de 20 a 24 °C también fueron el rango de cambio dramático de la viscosidad. Se podría imaginar que una vez que ocurriera una pequeña temperatura flotando en este rango durante la bioimpresión in situ, la viscosidad de la biotinta tradicional variaría drásticamente y traería riesgos impredecibles, mientras que la biotinta A-C puede mantener perfectamente la estabilidad de la viscosidad en gran medida y garantizar la validez del tratamiento.

Se estableció una escena de bioimpresión in situ simulada para evaluar la imprimibilidad de la biotinta A – C desde los estados de extrusión y deposición. Para el estado de extrusión, se seleccionaron y extruyeron tres temperaturas ambientales (4, 24, 37 °C) y A30/5 – C300/20 y C300/20 a un caudal constante. (Figura 4a). A 37 °C, la biotinta C estaba en un estado de solización excesiva y formaba gotas. A 4 ° C, la biotinta C estaba en un estado de gelificación excesiva y se había convertido en una masa de hidrogel en la jeringa, formando fragmentos de forma intermitente. La biotinta C mostró buena imprimibilidad sólo a 24 °C y formó filamentos uniformes. Sin embargo, la biotinta A – C, gracias a su gran robustez reológica, podría formar filamentos uniformes a las tres temperaturas. Para el estado de deposición, la temperatura ambiente se fijó en 24 °C para lograr el mejor estado de extrusión. Para simular las heridas de los pacientes, la plataforma receptora se configuró a 37 °C (temperatura corporal) y se untó un poco de solución colorante alimentario (sangre) (Fig. 4b). La biotinta A-C depositada podría mantener perfectamente la estructura 3D, mientras que la biotinta C se derritió gradualmente y se mezcló con la "sangre". Por tanto, la biotinta A – C mostraría una gran adaptación a las complejas condiciones que rodean las heridas. Además, la biotinta A-C se imprimió con éxito con una bioimpresora 3D comercial para establecer un cubo 3D con 12 capas y 7,5 mm de altura en una temperatura ambiente aproximadamente controlada (30 °C) y en el sótano receptor de la "herida". (Fig. 4c, Notas complementarias 5, 9 y Video complementario 3).

a El filamento extruido se forma a diferentes temperaturas. b Forma que se mantiene en "herida" llena de "sangre" a 37 °C. c Impresión 3D de un cubo en una "herida" llena de "sangre" a 37 °C con biotinta A-C. d Mecanismo de formación de la fuerza de unión estable. e Fricción interna en la interfaz. f Enlaces de hidrógeno entre grupos amino en tejido y grupos aldehído fotogenerados en GelMA. g Prueba de unión por tracción con biotinta A – C y tendón de cerdo. h Prueba de esfuerzo de unión de A30/5–C30/20 con tendón de cerdo. i Prueba de unión por compresión con biotinta A – C y costilla de cerdo. j Prueba de tensión de unión de A30/5–C300/20 con costilla de cerdo.

En la bioimpresión in vitro, las estructuras 3D se entrecruzan en la plataforma de deposición, lo que da como resultado una falta de fuerza de unión fuerte con los tejidos después del trasplante. Durante la terapia, el desplazamiento de las estructuras trasplantadas puede resultar inválido o peligroso para los pacientes. Por el contrario, la biotinta A-C depositada in situ formaría una fuerte fuerza de unión en la interfaz defecto/hidrogel (Fig. 4d). Esto se debe a que el componente C puede mostrar fluidez después de entrar en contacto con la temperatura corporal e infiltrarse fácilmente en la vacante del defecto, aumentando los sitios de unión en la interfaz y la fricción interna (Fig. 4e). Además, basándose en las propiedades químicas especiales de GelMA, las estructuras compuestas A – C pueden generar una fuerza de interfaz auxiliar en la herida, lo que probablemente se debió a la unión de grupos aldehído fotogenerados con los grupos amino en la superficie del tejido34 (Fig. 4f). Para observar claramente la fuerte fuerza de unión, se vertió biotinta A30/5-C30/20 sobre un tendón de cerdo fresco (Fig. 4g), mientras que se vertió biotinta A30/5-C300/20 sobre una costilla de cerdo fresca (Fig. 4i). Se agregaron fuerzas en todas las direcciones a las estructuras A – C (video complementario 4). Estructuras A-C fuertemente adheridas a la superficie del tejido. Para explorar la fuerza de unión entre la biotinta A-C y la superficie del tejido, se vertieron A30/5-C30/20 y A30/5-C300/20 (aproximadamente 2 mm de altura) y se fotocruzaron entre dos piezas de tendón de cerdo fresco (sección transversal era de aproximadamente 3 cm × 1 cm) y dos trozos de costillas de cerdo frescas (la sección transversal era de aproximadamente ⌀1,6 cm), respectivamente. La tensión de unión se probó mediante el método de estirar la estructura de tejido-hidrogel-tejido recortando dos trozos de tejido en la dirección opuesta a 1 mm/min. La tensión de unión entre A30/5-C30/20 y el tendón de cerdo podría alcanzar más de 4000 Pa (Fig. 4h) y la que existe entre A30/5-C300/20 y la costilla de cerdo podría alcanzar casi 6000 Pa (Fig. 4j). Se produjeron dos pasos en A30/5–C300/20 y la curva de nervadura porque A30/5–C300/20 era más adecuado para la compresión y formaría grietas durante la prueba de estiramiento. Todos los resultados indicaron que la biotinta A – C cumpliría con el requisito de una fuerte fuerza de unión.

En comparación con el método tradicional para establecer estructuras compuestas, es decir, la impresión de andamios reforzados seguido de la fundición de hidrogel blando, el método basado en biotinta A-C tiene una superioridad obvia. En primer lugar, el diseño de la estructura puede ser más flexible y fortalecer la red de andamios que se formaría espontáneamente alrededor de un componente. Además, debido a que los componentes A/C son ambos GelMA que poseen dobles enlaces carbono-carbono, durante la fotoentrecruzamiento, los dobles enlaces carbono-carbono sin reaccionar en la superficie de los microgeles GelMA en electropulverización se romperían y conectarían con los rotos en el componente C, formando fuertes enlaces covalentes en la interfaz A / C (Fig. 5a), que está ausente en los métodos tradicionales.

a Mecanismo del proceso de formación de enlaces covalentes estables de la estructura compuesta A-C. b Curva de ensayo de tracción. c Estado de tracción de diferentes biotintas. d Curva de ensayo de compresión. e Estado de compresión de diferentes biotintas. f Modelos de simulación de estructura compuesta A-C de tracción/compresión y celda unitaria. g Simulación compresiva de una estructura compuesta A-C. h Simulación de tracción de una estructura compuesta A-C.

Las propiedades de compresión de A30/5–C300/20, C300/20, A30/5–C30/5, C30/5 y las propiedades de tracción de A30/5–C30/20, C30/20, A30/5–C30/5 , C30/5. El módulo de compresión fue de 204,00, 2608,00, 16,26 y 3,73 kPa, respectivamente (Fig. 5b) y el módulo de Young fue de 1,81, 11,98, 0,80 y 1,26 kPa, respectivamente (Fig. 5d), lo que indica que el componente C obviamente fortaleció las propiedades mecánicas. de la estructura impresa, que también fue probada por la observación visual (Fig. 5c – e).

La distribución de tensiones dentro de la estructura compuesta A – C se analizó mediante simulación de elementos finitos. La estructura se simplificó como un modelo HCP (Fig. 5f). La condición límite de desplazamiento en el modelo de tracción/compresión se estableció en 50%/10%, respectivamente (Fig. 5g, h). En comparación con la estructura C, el alto estrés de Von Mises se distribuyó entre los microgeles en la estructura compuesta A-C, al igual que un fuerte andamio "impreso" en el interior, lo que hizo posible proporcionar una matriz extracelular (ECM) con un entorno mecánico similar en diferentes A-C. tipos de biotinta. Por analogía con el método de investigación de células unitarias en química cristalina, configuramos de manera innovadora el concepto de “celda unitaria A-C” con el mismo método de incisión que HCP, mostrando una red regular de alto estrés empaquetada en el interior de los microgeles de bajo estrés, ambos en compresión. /modelos de tracción.

Se electropulverizaron células estromales de médula ósea (BMSC) encapsulantes A30/5 y se cultivaron para utilizarlas posteriormente como unidades de terapia celular funcional en biotinta A – C. La viabilidad celular en los días 1, 4 y 7 demostró ser superior al 90% con el kit LIVE/DEAD (Fig. 6a), lo que indica la biocompatibilidad básica de A30/5 y la morfología de actina F mostró que las BMSC podrían propagarse gradualmente dentro del Microambiente 3D (Fig. 6b). Además, algunas BMSC que encapsulan A30/5 se cultivaron en medio de inducción osteogénica después de un cultivo básico de tres días. El séptimo día de inducción, se tiñó A30/5 con fosfatasa alcalina (ALP) y mostró que las BMSC inducidas habían entrado en la etapa osteogénica temprana (Fig. 6c). El día 21 de la inducción, A30/5 se tiñó con Alizarin Red S (ARS) y mostró que las BMSC inducidas habían entrado en la etapa osteogénica tardía y produjeron nódulos de calcio dentro de A30/5 (Fig. 6d), lo que verificó su capacidad de diferenciación osteogénica y posible efecto terapéutico. Además, A30/5 con BMSC experimentaría una fuerza de corte de la boquilla de impresión durante la impresión in situ, lo que podría causar apoptosis celular. A partir de los resultados de las pruebas de apoptosis con citometría de flujo (Fig. 6e), la apoptosis causada por la extrusión no fue obvia, lo que demuestra que el entorno blando formado por A30/5 podría proteger las BMSC encapsuladas de la fuerza de corte durante la extrusión y garantizar la función biológica.

a Viabilidad de las BMSC encapsuladas en microgeles GelMA. b Morfología de actina de las BMSC encapsuladas en microgeles GelMA. c Prueba de ALP del componente A cargado de BMSC inducidas osteogénicamente. d Prueba ARS del componente A cargado de BMSC inducidas osteogénicamente. e Prueba de apoptosis con Anexina V-FITC/PI mediante citometría de flujo. Para a – d, cada experimento se repitió de forma independiente con resultados similares 3 veces.

Para examinar la acción terapéutica de la biotinta A – C, se depositó biotinta A30/5 – C300/20 con o sin BMSC directamente dentro del defecto craneal de la rata (columna: diámetro 5 mm y altura 1,5 mm) y se fotoreticuló (Fig. 7a). En la segunda semana, la tomografía microcomputarizada reveló nueva formación de hueso en el grupo A – C cargado con BMSC (Fig. 7c). Sin embargo, no se formó ningún hueso nuevo evidente en el grupo en blanco, y el grupo sin BMSC mostró una cantidad muy limitada de regeneración ósea. Probablemente se debió a que los hidrogeles actuaron como andamio para las células relevantes en la ubicación original del defecto y proporcionaron más espacio de crecimiento. Además, el grupo A – C cargado con BMSC mostró una mejor eficacia de regeneración ósea con un BV / TV más alto (Fig. 7b). En la cuarta semana, el hueso unió casi por completo el sitio lesionado en el grupo A-C cargado con BMSC, y el grupo sin carga BMSC también mostró más crecimiento de tejido óseo nuevo. Los valores de BV/TV aumentaron con el tiempo en todos los grupos y tanto los grupos con BMSC cargado como sin BMSC fueron significativamente más altos que los del grupo en blanco. De acuerdo con el examen radiográfico, el análisis histológico con hematoxilina y eosina (Fig. 7d) y tinción con tricrómico de Masson (Fig. 7e) en la segunda semana reveló nueva formación de hueso con la mayor superficie en la muestra del grupo cargada con BMSC y sin formación ósea marcada. en grupos en blanco y sin BMSC. En la cuarta semana, la formación ósea aumentó en todos los grupos. Las observaciones histológicas con mayores aumentos confirmaron que el hueso neoformado con estructura típica en el grupo cargado con BMSC mostró muchas más regiones de formación de hueso maduro nuevo que los otros grupos, lo que indica que la biotinta A-C cargada con BMSC podría promover la formación de hueso endógeno en un momento crítico. Modelo de defecto craneal de rata de tamaño grande.

a Implantación y fotoentrecruzamiento de biotinta A – C en el modelo de defecto craneal de rata. b Valor BV/TV. (n = 5 ratas. Los datos se presentan como valor medio ± DE con GraphPad Prism 8.) Se utilizó ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparaciones múltiples post hoc de Tukey. Y la prueba estadística se realizó en los grupos de 2 semanas o de 4 semanas, respectivamente, pero no en los grupos de 2 y 4 semanas. c Examen por tomografía microcomputarizada. d Análisis histológico con tinción H&E. e Análisis histológico con tinción tricrómica de Masson. Para d, e, cada experimento se repitió de forma independiente con resultados similares 3 veces.

Los casos clínicos actuales de defecto orgánico son causados por todo tipo de accidentes, como incendios, accidentes de tráfico y lesiones militares. Por tanto, las morfologías y tamaños tridimensionales de los defectos del órgano son muy diferentes. Para examinar la capacidad de bioimpresión in situ de la biotinta A-C en un entorno clínico, se crearon cuatro “pacientes” de rata con defectos craneales con formas aproximadamente rectangular, cuadrada, trapezoidal y triangular (1,5 mm de altura) con un trépano dental (Fig. 8a-c). El sistema de brazo robótico se seleccionó como herramienta de bioimpresión in situ (Fig. 8b). Se colocaron cuatro “pacientes” ratas en la mesa de operaciones. Los modelos 3D de los defectos se reconstruyeron con software de diseño asistido por computadora y el programa de rutina de impresión se generó con software de corte y se cargó en el sistema de control del brazo robótico. Se depositaron in situ BMSC encapsuladas en biotinta A30/5-C300/20 en el defecto craneal de cuatro "pacientes" y se fotocruzaron con luz azul de 405 nm (vídeo complementario 5). Después de 6 semanas de implantación, la tomografía microcomputarizada reveló que se formó hueso nuevo desde el borde hacia el centro de los defectos en todos los "pacientes" (Fig. 8d, e), lo que verificó la alta viabilidad de la biotinta A-C en -Terapia de bioimpresión situ.

Una morfología de estructura 3D de los modelos de defectos craneales de rata. b Pasos de bioimpresión in situ con biotinta A – C. c Morfología del defecto craneal original del "paciente". d Examen de tomografía microcomputarizada después de un tratamiento in situ de 6 semanas. e Valor BV/TV después de 6 semanas de tratamiento in situ.

La mayoría de los estudios actuales sobre biotintas basadas en microgeles solo depositan microgeles recolectados in vitro/vivo para formar estructuras 3D, que pueden colapsar o ser empujadas hipodérmicamente fuera del sitio de la herida con las actividades diarias de los pacientes. Mientras tanto, las excelentes características y la revolución de la biotinta basada en microgel se han ignorado en la bioimpresión in situ. El biotinta de biohormigón propuesto aquí contenía un componente de cemento bajo demanda, es decir, una solución precursora de hidrogel diferente en el sistema de biotinta, y la interacción entre el agregado y el componente de cemento resolvió con éxito los problemas que se han restringido en el desarrollo de investigaciones clínicas in situ. bioimpresión. Al combinar las prometedoras propiedades reológicas de los microgeles y la capacidad de ajuste mecánico de GelMA, la biotinta A – C mostró una buena robustez de impresión in situ, simplicidad en el establecimiento de la estructura compuesta, acción terapéutica in vivo, fuerza de unión en la interfaz tejido/hidrogel y portabilidad.

Hasta ahora, se han propuesto cada vez más métodos de fabricación de microtejidos funcionales. Además, el componente A cargado de células se puede preinducir fácilmente con un medio de inducción específico y almacenar en nitrógeno líquido para una mejor portabilidad y efecto terapéutico, lo que permite realizar la producción y el transporte en masa de biotinta A-C para cumplir con los requisitos clínicos. . Creemos que la biotinta A – C desempeñará un papel importante en el tratamiento de defectos de órganos y dará un gran impulso para desarrollar tecnología clínica de bioimpresión in situ.

En el futuro, la biotinta A-C podrá diseñarse de más formas. Para el componente A, las especies de células en el componente A se pueden cambiar para obtener más funciones (Nota complementaria 7). Además, en nuestro estudio anterior35 se fabricaron microgeles jerárquicos, con los que se pudieron realizar acciones de tratamiento sinérgicas. Para el componente C, GelMA es el único biomaterial aplicado aquí y otros biomateriales podrían ser sustitutos, como el ácido hialurónico metacriloilo (HAMA) con alta ajustabilidad mecánica36,37,38,39,40. Además, en la exploración, encontramos que el componente A que encapsula las células endoteliales podría ser vascularizado por el componente C que encapsula las células tumorales que secretan el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)41,42 (Nota complementaria 8), lo que probablemente realizaría la vascularización in situ en los defectos de los órganos. Además, el problema del suministro de nutrición/gas en la estructura de hidrogel a gran escala es un problema común tanto en la bioimpresión in situ como en la bioimpresión in vitro. Afortunadamente, los investigadores de nuestro laboratorio43 o de otros laboratorios44 han propuesto una serie de formas efectivas de resolver este problema. Por lo tanto, en el futuro, la biotinta A-C de próxima generación podría diseñarse con un componente sacrificado o un componente de separación de fases para formar más red de nutrición en la estructura A-C.

Teniendo en cuenta la portabilidad y la viabilidad de múltiples escenas, hacemos un llamado al desarrollo de equipos inteligentes y portátiles para la bioimpresión in situ de biotinta A-C en el futuro. Como suposición, se podría diseñar un dispositivo de calentamiento integrado de botella compuesta, una batería portátil y una linterna. Además, desde el punto de vista del desarrollo urbano, se pueden establecer “estaciones de nitrógeno”, como gasolineras, y “bioimpresoras in situ portátiles compartidas”, como bicicletas compartidas, en puestos públicos como servicio social, de modo que el almacenamiento a largo plazo de biotinta A-C en Se pueden garantizar viajes largos y la inmediatez de la bioimpresión in situ.

Se preparó una solución de prepolímero GelMA pura al 5% (p/v) disolviendo el GelMA liofilizado (EFL-GM-30, pureza > 99,9%) y fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP, 0,5% (p). /v), pureza > 99,8%) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La solución se filtró a través de un filtro de 0,22 µm. Se formó un campo eléctrico con la boquilla metálica (30 G) y el anillo metálico. El caudal de tinta de electropulverización se estableció en 50 μL/min y fue impulsado por una bomba de inyección. El voltaje se fijó en 2,86 kV. La temperatura ambiente se fijó en 30 °C para asegurar la fluidez adecuada de la tinta de electropulverización. Las microgotitas electropulverizadas se recibieron en una placa de Petri llena de aceite de silicona y se reticularon con luz azul de 405 nm. Los microgeles GelMA reticulados se transfirieron a un tubo de centrífuga y se centrifugaron a 128,57 xg durante 5 minutos (3 veces) para eliminar el aceite de silicona. Los microgeles se almacenaron en PBS. Para los microgeles GelMA cargados de BMSC, las BMSC se mezclaron en la tinta de electropulverización a una densidad celular de 5 x 105 células/ml. Los microgeles GelMA cargados con BMSC preparados se cultivaron en medio completo DMEM/F-12 suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 % (v/v) a 37 °C y CO2 al 5 %.

La solución pura de prepolímero GelMA se preparó disolviendo el GelMA liofilizado (EFL-GM-30/EFL-GM-300, pureza > 99,9%) y fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP, 0,5% (p/p). v)) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La solución se filtró a través de un filtro de 0,22 µm.

Para las pruebas reológicas de la biotinta A – C, se seleccionó un rotor de placa paralela de 25 mm y el espacio de prueba se estableció en 2,5 mm (aproximadamente 5 veces el diámetro del componente A). Para las pruebas reológicas de biotinta C, se colocaron un rotor de placas paralelas de 25 mm y un espacio de prueba de 1 mm en la prueba de 4 °C y un rotor de placas paralelas de 50 mm y un espacio de prueba de 0,5 mm en las temperaturas de 24 y 37 °. Pruebas C. Para las pruebas de barrido de flujo, el rango de velocidad de corte se estableció entre 0,1 y 100 s-1. El ajuste de datos con el modelo de fluidos de Bingham se realizó con MATLAB. Para las pruebas de frecuencia de oscilación, la amplitud se estableció en 1% y el rango de frecuencia se estableció en 1000–0,1 rad/s. Para las pruebas de tixotropía, se añadió a las muestras la amplitud de oscilación periódicamente variada (200% y 1%). El período de alternancia se estableció en 30 s y se examinaron cinco puntos en cada etapa y se repitieron tres veces. Para la prueba de rampa de temperatura de flujo, la biotinta experimentó enfriamiento/calentamiento tres veces de un lado a otro. La velocidad de cambio de temperatura se estableció en 5 °C/min.

Para las muestras compresivas, se vertió biotinta A30/5–C300/20, C300/20, A30/5-C30/5 y C30/5 en el molde cilíndrico (φ9 mm × 6,3 mm) y se reticuló con azul de 405 nm. luz. Para las muestras de tracción, se vertió biotinta A30/5–C30/20, C30/20, A30/5–C30/5 y C30/5 en el molde cuboide (20 mm × 3 mm × 5 mm). La prueba mecánica se llevó a cabo en una máquina de prueba de muestras de hidrogel. La velocidad de movimiento se fijó en 1 mm/min. La simulación mecánica se ejecutó con COMSOL Multiphysics. Las relaciones de Poisson de las estructuras C30/20 y C30/5 se establecieron en 0,034 y 0,031, respectivamente. La condición de contorno de desplazamiento en la simulación de tracción se estableció en el 50% de la longitud original del modelo. Las relaciones de Poisson de las estructuras C300/20 y C30/5 se establecieron en 0,218 y 0,031, respectivamente. La condición de contorno de desplazamiento en la simulación de compresión se estableció en el 10% de la longitud original del modelo.

Las BMSC (células primarias de ratas) fueron proporcionadas por el Hospital de Estomatología, la Facultad de Estomatología, la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, el Centro Provincial de Investigación Clínica de Enfermedades Bucales de Zhejiang, el Laboratorio Clave de Investigación Biomédica Oral de la Provincia de Zhejiang, el Centro de Cáncer de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou 310006. Los microgeles GelMA cargados con BMSC electropulverizados se cultivaron en medio completo DMEM/F-12. La viabilidad de BMSC se midió después de 1, 4 y 7 días. La viabilidad celular se probó con el ensayo Vivo/Muerto durante 40 min. Posteriormente, se aplicó CLSM para obtener imágenes de las BMSC encapsuladas obteniendo dos imágenes de cada cuadro: verde para células vivas y rojo para células muertas. El número de células vivas y muertas se analizó con ImageJ y la viabilidad de BMSC se calculó como la relación entre el número de células vivas y el número total de células. Para conocer la morfología de las BMSC encapsuladas, se tiñeron con un tinte citoesquelético, incluida actina, que se tiñó con faloidina TRIC (40734ES75, Yeasen Biotechnology), y el núcleo se tiñó con DAPI. Se tomaron imágenes del componente A cargado de BMSC con CLSM.

Los microgeles GelMA cargados con BMSC electropulverizados se cultivaron en medio completo DMEM/F-12 durante 3 días. Posteriormente, se preparó medio de inducción osteogénica DMEM/F-12 con dexametasona (0,1 mM), hidrato de sal disódica de β-glicerol fosfato (10 mM) y ácido l-ascórbico (50 µg/ml). Los microgeles GelMA cargados con BMSC se indujeron con el medio de inducción preparado. El séptimo día, el componente A cargado de BMSC se fijó con poliformaldehído al 4% (p/v) durante 30 minutos y se tiñó con fosfatasa alcalina (ALP). El día 21, el componente A cargado de BMSC se fijó con poliformaldehído al 4% (p/v) durante 30 minutos y se tiñó con Alizarin Red S. Las muestras teñidas se observaron con un microscopio óptico.

El A30/5 con BMSC se electropulverizó como se indicó anteriormente, la mitad del cual se extruyó desde una boquilla en forma de cono de 20 G a 150 μL/min. Después de un cultivo de 4 h, el A30/5 extruido y no extruido con BMSC se degradó con una solución de PBS de colagenasa II de 20 U/ml durante 30 minutos (37 °C) para eliminar el hidrogel GelMA. Las células recolectadas se tiñeron con kits de Anexina V-FITC/PI y se analizaron mediante citometría de flujo, respectivamente. Los datos fueron analizados con el software FlowJo.

El Centro de Experimentación Animal de la Universidad de Zhejiang (Hangzhou, China) proporcionó treinta ratas SD macho de 12 semanas de edad (250–300 g). Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética para la Investigación con Animales de la Universidad de Zhejiang (número de aprobación de ética: ZJU20210172) y se realizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Zhejiang. Las ratas SD fueron asignadas aleatoriamente a grupos, incluyendo microesferas de hidrogel en blanco, de hormigón en blanco y de hormigón inducido, para evaluar el potencial osteogénico en un defecto craneal en la implantación de microesferas de hidrogel. Se anestesiaron ratas SD con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 2%. Después del afeitado y desinfección completos, se realizó una incisión longitudinal en el medio del área quirúrgica y luego se separó cuidadosamente el tejido blando para exponer la calota. Se eliminó el periostio y se crearon dos defectos bilaterales de 5 mm de diámetro con un trépano dental. Luego se implantaron las microesferas de hidrogel en los defectos. Se inyectó penicilina una vez al día después de la operación durante tres días.

Después de 2 y 4 semanas de implantación, las ratas (n = 5 en cada grupo) fueron sacrificadas por asfixia con CO2, y la muestra de calvario se recogió y se fijó en paraformaldehído al 4% (p/v) para una mayor caracterización. Las estructuras tridimensionales (3D) del tejido óseo regenerado dentro del área del defecto craneal se evaluaron con micro-CT (SkyScan, SkyScan 1176, Bélgica) con los siguientes parámetros de escaneo: una resolución de 18 μm, voltaje de 65 kV, corriente de 385 μA, y filtro A1 de 0,5 mm. La reconstrucción 3D se realizó con el software del sistema (SkyScan, Bélgica). La relación entre el volumen óseo y el volumen de tejido (BV/TV) se determinó cuantitativamente con un cilindro ROI de 5 mm de diámetro.

Después de 2 y 4 semanas de implantación, las muestras recolectadas se fijaron en paraformaldehído al 4% (p/v) durante 48 h y se descalcificaron en una solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 15% durante 2 semanas a temperatura ambiente. La solución de EDTA se renovó cada 3 días. Luego, las muestras se deshidrataron mediante una serie de alcoholes graduados y se incluyeron en parafina. Se obtuvieron secciones histológicas con un espesor aproximado de 5 μm del centro de las muestras incluidas, seguidas de tinción con hematoxilina y eosina (H&E) o tricrómico de Masson para evaluar la formación ósea. Las imágenes se obtuvieron con un microscopio de campo brillante (Olympus, Tokio, Japón).

Las diferentes morfologías de los defectos craneales se crearon con un trépano dental (5 mm de diámetro, 1,5 de altura). Las morfologías de los defectos de los "pacientes" I, II y III eran de forma rectangular, cuadrada y trapecio, respectivamente, con 2, 4 y 5 círculos, y la distancia entre centros era de 1 mm. La morfología del defecto del "paciente" IV era de forma triangular con 3 círculos y la distancia entre centros era de 4 mm. Los modelos de defectos se reconstruyeron en Solidworks y se cortaron con el software Repetier para adquirir la información de la ruta, seguido de la transferencia al programa de control correspondiente que utilizó el software de control del sistema de brazo robótico. El caudal de biotinta se estableció en 150 μL/min y la velocidad de movimiento de la boquilla se estableció en 120 mm/min. Se seleccionó la boquilla en forma de cono 20G como boquilla de impresión. El punto original X-Y de la boquilla se configuró de acuerdo con el borde posterior derecho del defecto craneal, y el punto original Z se configuró de acuerdo con el punto más alto del cráneo alrededor del defecto. La bomba de inyección se fijó en el extremo del sistema de brazo robótico. Después de la impresión de biotinta A – C, la biotinta depositada se entrecruzó con luz azul de 405 nm durante 30 s y el cuero cabelludo se suturó y esterilizó.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los autores declaran que todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y su Información complementaria o a través de los autores correspondientes previa solicitud.

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Este estudio fue patrocinado por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2018YFA0703000, YH), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. U1909218, YH), el Fondo Científico para Grupos de Investigación Creativos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China. (Nº T2121004, YH).

Estos autores contribuyeron igualmente: Mingjun Xie, Yang Shi.

Laboratorio estatal clave de sistemas mecatrónicos y de energía fluida, Escuela de Ingeniería Mecánica, Universidad de Zhejiang, 310027, Hangzhou, China

Mingjun Xie, Jingbo Zhang, Zichen Chen, Jianzhong Fu y Yong He

Laboratorio clave de procesos y equipos de impresión 3D de la provincia de Zhejiang, Escuela de Ingeniería Mecánica, Universidad de Zhejiang, 310027, Hangzhou, China

Mingjun Xie, Jingbo Zhang, Zichen Chen, Jianzhong Fu y Yong He

Hospital de Estomatología, Facultad de Estomatología, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, 310006, Hangzhou, China

Yang Shi, Chun Zhang, Mingjie Ge y Zhijian Xie

Centro Provincial de Investigación Clínica de Enfermedades Bucales de Zhejiang, 310006, Hangzhou, China

Yang Shi, Chun Zhang, Mingjie Ge y Zhijian Xie

Laboratorio clave de investigación biomédica oral de la provincia de Zhejiang, 310006, Hangzhou, China

Yang Shi, Chun Zhang, Mingjie Ge y Zhijian Xie

Centro Oncológico, Universidad de Zhejiang, 310058, Hangzhou, Zhejiang, China

Yonghe

Laboratorio clave de procesamiento de materiales y moldes, Universidad de Zhengzhou, 450002, Zhengzhou, China

Yonghe

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MX realizó todos los experimentos de fabricación y in vitro y escribió el artículo con el aporte de todos los autores. YS realizó los experimentos y la caracterización con animales. CZ y MG ayudaron a realizar los experimentos y la caracterización con animales. JZ ayudó en el diseño del programa de ruta de bioimpresión in situ y la operación del brazo robótico. JF, ZC y ZX contribuyeron al diseño del estudio. YH organizó el proyecto y dio sugerencias de proyecto.

Correspondencia a Yong He.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Junji Fukuda y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

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Xie, M., Shi, Y., Zhang, C. et al. Bioimpresión 3D in situ con biotinta de biohormigón. Nat Comuna 13, 3597 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30997-y

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Recibido: 09 de noviembre de 2021

Aceptado: 20 de mayo de 2022

Publicado: 23 de junio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30997-y

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